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PCR技术原理及荧光PCR方法全面解读

发表者 亿得 | 2023-03-29

在对新冠病毒的核酸检测中,PCR技术起到了核心作用,可以帮助检验人员快速、准确的判断是否感染新冠病毒。

那究竟什么是PCR技术呢?

(一) PCRPolymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)的首字母缩写,简单说来,PCR是由高温变性低温退火中温延伸三个基本反应步骤构成:

 

01 DNA的变性成为单链模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链解离成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

 

02低温退火模板DNA变性成单链后,将其温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

 

03中温延伸DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

 

(二) 荧光PCR方法目前我国国家药品监督管理局批准的新冠病毒检测试剂,大部分采用的都是荧光PCR方法来检测新冠病毒。荧光PCR方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团,随着PCR扩增的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加,最后通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图,对PCR进程进行实时检测。

 

(三) PCR耗材选择原则

1. 看材质PCR 耗材一般都是 PP 材质,因为 PCR/qPCR 耗材通常会与试剂或样品直接接触,而聚丙烯(PP)材质是生物学惰性材料,表面不易于粘附生物分子,且有着良好的化学耐性及温度耐受性(可以 121 高压灭菌,也可以承受热循环过程中的温度变化)。亿得PCR耗材皆是PP材质。

2. PCR /板体积不同体积的 PCR /板,该如何挑选?

选择宗旨:依据具体的实验要求选用合适的产品。PCR管的体积大多数都可以满足 PCR 反应的要求。对于低到中通量的PCR/qPCR实验,PCR管是比较理想的选择,单个管和联管是两种最常用的形式。单管提供了设置准确运行反应数量的灵活性。另外,反应体积更大时,可选择0.5 mL规格的单管。

联管通常以812管形式,管盖分开或带有管盖。可兼容单通道和多通道移液器,适用于低通量和中通量实验。带有管盖的联管可独立打开和关闭样品管,以防止样品污染。

常见反应管的规格及体积:

单管/联管:0.5 mL0.2 mL0.1ml0.15 mL

96 孔板:0.2 mL0.15 mL0.1ml

384孔板:0.02 mL

 

3. 看管壁厚度

管壁厚度会直接影响热传导率,极薄的壁厚可优化热传递减少循环时间。超薄壁塑料比标准版薄约50%,进一步减少了热障,从而带来更快,更稳健的反应。亿得生物PCR耗材皆是超薄管壁。

 

4. 看颜色

PCR板通常可提供多种不同的颜色形式,以便于对于样品的视觉区分和鉴别,特别是在高通量实验中。对于普通的 PCR 反应选用透明或者彩色的 PCR 管都是可以的,而透明的 PCR 管更有助于进行样品分类管理。尽管塑料的颜色对DNA扩增没有影响,但 qPCR 更推荐选用优质的白色 PCR 耗材。由于 qPCR 需要实时定量检测荧光信号强度,更需要灵敏、精确的荧光信号传递。实验证明,与传统的透明 PCR 产品相比,白色 PCR 产品可最大程度地反射荧光信号,减少孔间信号交叉污染,可优化实时荧光定量 PCR 的结果。

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